首頁Rho1D4純化體系：為重組膜蛋白提取設(shè)計
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Twiitter膜蛋白的重要性不言而喻，假如細胞膜是守護細胞的城墻，而膜蛋白就是站在城墻上的各司其職的士兵，肩負著把守城門、傳遞信號、運輸物質(zhì)等重要職責。膜蛋白一旦“失守”，就會造成細胞功能紊亂，進而引起組織和器官發(fā)生病變，使身體遭受病痛侵擾。這也就是為什么膜蛋白成為大多數(shù)重要的藥物研究對象和靶點。
在人體蛋白中，有大約30%是膜蛋白，F(xiàn)DA批準的新藥中，大多數(shù)都以膜蛋白為靶點，幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點。然而讓人吃驚的是，樂觀估計，目前已經(jīng)被透徹研究清楚結(jié)構(gòu)的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。
究其原因，是因為膜蛋白依附或橫跨在細胞膜的磷脂雙分子層上，使膜蛋白的表達、純化、結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析都有很大難度。由于非常難以獲得高純度的膜蛋白，進而解析它們的結(jié)構(gòu)和功能，使根據(jù)膜蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計藥物的方法難以施展，而這種方法是目前開發(fā)藥物有效的方法之一，因為藥物要能有效治療并且使副作用盡量減小，作用位點就必須精準。
很多科研人員想深入研究膜蛋白，希望攻克困擾人類的各種疾病，但由于提取高純度目標膜蛋白并不便捷，從而影響研發(fā)進度。市面上有一些專用于膜蛋白提取的試劑盒，大多數(shù)只能提取某幾種類型的膜蛋白，有些試劑盒用于提取膜總蛋白（包括質(zhì)膜和細胞器膜蛋白）。
目前，有一種新型膜蛋白提取工具能夠特異性親和純化重組膜蛋白，并具有高純度、高特異性、高載量、溫和提取的優(yōu)點，是基于1980年科學家在牛眼視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的一種命名為Rho1D4的氨基酸序列以及其對應的抗體來作為親和標簽純化膜蛋白取得了非常好的效果，將Rho1D4抗體鏈接在瓊脂糖或磁珠上，用于親和層析帶有Rho1D4標簽的膜蛋白，能近乎完美的解決這些研究難題。
Rho1D4是指在牛眼視網(wǎng)膜細胞內(nèi)的牛視紫紅質(zhì)C端的后九位氨基酸。Rho1D4得名于與該序列特異性結(jié)合的單克隆抗體1。與Rho1D4抗體結(jié)合的表位可以作為針對膜蛋白的高特異性純化標記。
通過基因修飾可在欲研究的目標（膜）蛋白C端加上Rho1D4標記（如圖1）。一旦加載上該序列，即可用裝載有Rho1D4抗體的親和基質(zhì)去捕獲目標蛋白，隨后添加Rho1D4肽，通過競爭性結(jié)合基質(zhì)抗體的方式來洗脫目標蛋白。采用這種方法，相比改變pH值等其他洗脫方式，更加地溫和。
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圖1：假設(shè)有3個跨膜域的膜蛋白。Rho1D4標簽加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A |
2）Rho1D4的歷史
Rho1D4的表位和抗體配對于20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)，當時科學家將Rho1D4抗體交聯(lián)包被在瓊脂糖凝膠上，用來純化通過猴腎細胞表達的牛視紫紅質(zhì)。1,2 從那時起，Rho1D4系統(tǒng)開始被廣泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體），ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶質(zhì)反向轉(zhuǎn)運體和以及一種含四個跨膜域的膜蛋白。
高純度
Rho1D4系統(tǒng)包含：標簽、抗體偶聯(lián)親和基質(zhì)（瓊脂糖或磁珠等）以及洗脫多肽。Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)勢在于抗體與抗原相互作用的高度特異性。表位序列和鏈長對結(jié)合至關(guān)重要。例如，將第三位丙氨酸替換成甘氨酸，即移去一個甲基基團，抗體將不再與表位結(jié)合。同樣，完整的九個氨基酸標簽會與Rho1D4抗體結(jié)合緊密，去除兩個氨基酸則阻斷結(jié)合。因此，含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特異性結(jié)合被盡量減少，因此回收蛋白的純度非常高。（見表1）3,4,5,6,7,8
高回收量
而Rho1D4系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是洗脫目標蛋白的高回收率。包括細菌，酵母和哺乳動物細胞系在內(nèi)的表達系統(tǒng)已經(jīng)針對特定的GPCR和其他膜蛋白進行了優(yōu)化。用Rho1D4系統(tǒng)純化后的膜蛋白通過凝膠過濾以除去用于洗脫的多肽。使用此純化系統(tǒng)的科研人員均反饋蛋白回收量均達到毫克級。（見表1）3,4,5,6,7,8
純化的膜蛋白可用于功能性研究
純化的蛋白可用于功能性研究，如配體結(jié)合的特性，蛋白與蛋白間的相互作用。例如，將標記過的ABCA4固定在載有Rho1D4抗體的基質(zhì)上來確定它與天然配體（一種視網(wǎng)膜的加成物）的親和結(jié)合特性，加入ATP后即釋放2。又例如，CD81蛋白被整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現(xiàn)出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結(jié)合力3。另外，有陰離子轉(zhuǎn)運載體AE1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白被標記且用Rho1D4系統(tǒng)純化后表現(xiàn)出與紅細胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4）利用Rho1D4純化膜蛋白圖解簡述
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步驟1： 結(jié)合 將Rho1D4標記的蛋白與載有Rho1D4抗體的瓊脂糖一同孵育使得目標蛋白被固定在吸附材料上。 | 步驟2： 清洗 將雜蛋白和其他裂解液成分洗去，留下與親和基質(zhì)結(jié)合的目標蛋白。 | 步驟3： 洗脫 過量Rho1D4肽與基質(zhì)競爭性結(jié)合，釋放出目標蛋白在洗脫液中收集。 |
蛋白 | 表達系統(tǒng) | 純度 | 產(chǎn)率 | 采取的純化步驟 |
hCB2 | 大腸桿菌 | 90% | 4.5mg/5L 培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC+SEC |
hVN1R1 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | 90% | 1mg/1g細胞 | Rho1D4 IAC+SEC |
FPR3 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | 90% | 2mg/6g細胞 | Rho1D4 IAC+SEC |
TAAR5 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | 90% | 1mg/9g細胞 | Rho1D4 IAC+SEC |
OR131-2 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | 90% | 2.9mg/10g細胞 | Rho1D4 IAC, |
hOR17-4 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | 90% | 7.5mg/2.5L, 培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC+SEC |
hOR17-4 | 無細胞小麥胚芽提取物 | 70%* | 0.3mg/mL, 反應溶液* | Rho1D4 IAC+SEC |
CD81 | 可誘導的HEK293S細胞系（哺乳動物） | ＞95% | 26μg/3×107, 個細胞 | Rho1D4 IAC |
AE1 | S.啤酒系BJ5457 | 93% | 2.5mg/18L. 培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC |
*純度是從低濃度經(jīng)一步Rho1D4 IAC在反應溶液中得出的；產(chǎn)率是在洗脫成分濃縮并過SEC柱后計算的。
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