首頁Nanodisc 在 GPCR 抗體研發(fā)中的應(yīng)用
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TwiitterGPCR（ Guanosine-binding Protein Coupled Receptor）中文名稱為G蛋白偶聯(lián)受體，是一種膜蛋白受體。GPCR作為細胞信號傳導中的重要蛋白，其共同點是其蛋白體結(jié)構(gòu)中都有七個跨膜結(jié)構(gòu)。研究顯示GPCR參與了很多細胞信號轉(zhuǎn)導過程，當膜外的配體作用于該受體時，該受體的膜內(nèi)部分與G蛋白發(fā)生結(jié)合，從而激活G蛋白。G蛋白可通過兩種途徑傳遞細胞外的信息：第一種方式是打開跨膜離子通道，讓外界的離子進入；第二種方式是激活第二信使，如：cAMp、IP3/DAG等。簡單來講，GPCR能結(jié)合細胞周圍環(huán)境中的化學物質(zhì)并激活細胞內(nèi)的一系列信號通路，引起細胞狀態(tài)和功能的改變，同時參與多種生命活動以及內(nèi)分泌與代謝等多種生理過程。從疾病方面來看，GPCR也與糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫疾病等重要疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)。
隨著科研和生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的不斷深入，GPCR的重要性也愈發(fā)顯現(xiàn)，為了表彰在這一領(lǐng)域的貢獻，2012年諾貝爾化學獎授予了兩位美國科學家：羅伯特·萊夫科維茨（Robert J. Lefkowitz）和布萊恩·科比爾卡（Brian K. Kobilka），他們因“G蛋白偶聯(lián)受體”研究領(lǐng)域的杰出貢獻而獲獎。從生物醫(yī)療領(lǐng)域的數(shù)據(jù)來看，大約40%的現(xiàn)代藥物都以GPCR作為靶點。而至少有三分之一的小分子藥物是GPCR的激活劑或者拮抗劑，在暢銷藥物排行中就有眾多藥物屬于GPCR相關(guān)藥物，比如：充血性心力衰竭藥物Coreg、高血壓藥物Cozaar、乳腺癌藥物Zoladex等，而還有更多這樣的候選藥物小分子在臨床研發(fā)中。
針對GPCR的分類，主流有兩種方法：一是A-F分類系統(tǒng)，面向所有生物體內(nèi)的GPCR蛋白；第二種是將GPCR蛋白被分為Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2這5類。按照第二種分類標準來看，Rhodopsin受體類是GPCR家族中大的一類，而其下還分為多種亞家族。而整個Rhodopsin家族包含各種重要受體，如組胺受體、多巴胺受體、內(nèi)皮素受體、催產(chǎn)素受體等。而其它類GPCR也包含眾多受體種類，如鈣敏感受體、甜味味覺受體等。
現(xiàn)階段，作為開發(fā)藥物靶點的受體約370個，分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族內(nèi)。這些GPCR主要與生理代謝和疾病的形成有關(guān)，包括癌癥、炎癥、感染、代謝疾病等。藥物作用于GPCR靶點，其主要的作用是阻斷或激活胞外信號對靶點的激活，調(diào)控由靶點介導的胞內(nèi)信號傳導以及阻斷病毒通過靶點侵入。作用于GPCR受體的藥物可以是小分子藥物或抗體類藥物，相對于小分子藥物，單克隆抗體藥物治療GPCR相關(guān)疾病擁有多方面優(yōu)勢?？贵w在體內(nèi)的清除率更低，作用時間更長；并且在給定劑量下，抗體的血漿濃度的個體差異更小。另一方面在藥物開發(fā)方面，對于一些受體，小分子藥物通過高通量篩選階段的陽性率很低，成藥難度大。此外單抗藥物可以具有對受體更高的特異性以及避免一些小分子要會帶來的副作用，如小分子藥物可以穿過血腦屏障引起藥副作用?，F(xiàn)針對GPCR受體，用于治療癌癥、炎癥和感染的很多抗體藥物已經(jīng)進入臨床或上市，而更多的其它抗體藥物正在加緊研發(fā)的過程中。
圖1.GPCR抗原主要形式（來源：參考文獻3）
篩選方法分為體內(nèi)免疫和展示篩選。其中體內(nèi)免疫法是常用和經(jīng)典的方法之一，通過用抗原免疫動物，然后從動物的脾臟中分離B細胞，制備雜交瘤，篩選單克隆抗體。而是否能更好的得到產(chǎn)生目標抗體的B細胞，用與引起免疫反應(yīng)的抗原的穩(wěn)定性、單一性、期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的位點是否外露、不期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的部分是否被包裹都顯得尤為重要。
圖2：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(來源Cube Biotech)
1、Nanodisc可以為GPCR提供一個類似細胞膜雙分子層的結(jié)構(gòu)，使其原有的結(jié)構(gòu)和功能可以被保護。同時跨膜區(qū)域和膜外區(qū)域也能和在細胞膜上一致，避免了直接使用純GPCR作為抗體會產(chǎn)生的結(jié)合跨膜區(qū)域的抗體形成的問題。同時，通過Nanodisc包裹的GPCR作為抗原也避免的直接使用細胞膜碎片作為抗體會引起高背景等問題，使后續(xù)篩選難度大大降低。
2、Nanodisc 包裹完整GPCR，不會有使用合成胞外N端或loop區(qū)制作抗原造成的表位容易遺漏和失真的問題。
3、Nanodisc通過膜支架蛋白固定磷脂，使其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，從而避免了使用脂質(zhì)體包裹GPCR作為抗原的不穩(wěn)定和易破裂等問題。
4、為了針對不同的應(yīng)用要求，膜支架蛋白可以是人源化或鼠源化的，如此可以避免用鼠作為免疫動物，人源化的膜支架蛋白會引起不必要的免疫反應(yīng)。
在去污劑存在條件下將GPCR純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
圖3：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機制
(圖片來源Cube Biotech官方網(wǎng)站)
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復合物。右圖：預組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的GPCR能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。
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22. G protein–coupled receptor
23. 諾貝爾化學獎:G蛋白偶聯(lián)受體-生物通文
24. 生物制藥小編
