膜蛋白在細胞與外界進行物質(zhì)、信息、能量交換中具有重要的作用和意義，因此膜蛋白成為了當(dāng)前研究熱點之一。但是由于膜蛋白存在疏水部分，因此在體外容易聚合，所以需要找到一種合適的方法讓膜蛋白能夠穩(wěn)定地存在于細胞外的環(huán)境。傳統(tǒng)的膜蛋白提取方法是利用去污劑來提取，但是經(jīng)過去污劑提取后的膜蛋白其構(gòu)象和生物學(xué)活性都較易因為各種問題被破壞，作為“鑲嵌”在細胞膜磷脂雙分子層中的蛋白，一旦脫離了其穩(wěn)定的天然膜環(huán)境，便會影響甚至失去其生理功能，即使膜蛋白被成功地提取出來，也達不到很好的研究結(jié)果。
早在上個世紀(jì)90年代，來自University of Illinois的生化學(xué)家Stephen Sligar教授就提出了一種命名為“Nanodisc”的磷脂層結(jié)構(gòu)，能夠有效地解決膜蛋白提取后在體外環(huán)境中穩(wěn)定存在的問題，從而確保膜蛋白能夠像在天然的細胞膜中維持其構(gòu)象和生物學(xué)功能。Nanodiscs這種全新的膜蛋白提取工具突破了原有提取方法的瓶頸，能夠高效而溫和地輔助于膜蛋白的提取和保持其構(gòu)象，這種全新的膜蛋白提取輔助工具可以解決以上傳統(tǒng)提取方法容易出現(xiàn)的問題。
Nanodiscs已經(jīng)應(yīng)用于許多著名的科研院校、制藥企業(yè)，推動了膜蛋白相關(guān)領(lǐng)域的研究進展。本文將對這種技術(shù)做一個詳細的解讀與應(yīng)用說明。
1）什么是Nanodiscs?
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。通過這種特殊的結(jié)構(gòu)，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持其生物學(xué)活性，為膜蛋白研究提供了有力的技術(shù)支持，打通了膜蛋白研究中的瓶頸之一。
膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤狀的結(jié)構(gòu)，即納米盤3。其包含一個朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時在沒有去污劑的情況下也可以使膜蛋白溶解。
常用的磷脂為二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)，它們可以與(apo) A-I組裝成納米盤，并與溶解膜蛋白的去污劑膽酸鈉一起結(jié)合使用。
圖1：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白。
根據(jù)所使用的MSPs的不同，形成的Nanodiscs的直徑會有所差異，這些納米級雙層微粒的直徑約為7-13納米。應(yīng)用廣泛的MSPs包括MSP1D1、MSP1D1-dH5和MSP1E3D1。具體尺寸見表1。
表1 不同類型的MSPs的尺寸
MSP類型 | 尺寸(nm) |
MSP1D1 | 9.5(+/-1.1) |
MSP1D1-dH5 | 8.2(+/-0.6) |
MSP1E3D1 | 13(+/-1) |
2）為什么選擇Nanodiscs
在膜蛋白研究方面，尤其是配體結(jié)合研究、構(gòu)象動力學(xué)分析以及蛋白相互作用的研究，Nanodiscs體系與其他體系相比有諸多優(yōu)勢4。Nanodiscs可以使膜蛋白，如GPCRs或轉(zhuǎn)運蛋白等，在人造環(huán)境里和納米盤重新組裝起來，形成類似天然的細胞膜結(jié)構(gòu)。這種組裝到Nanodisc中的可溶性蛋白可以在沒有去污劑的情況下用常規(guī)的層析方法來進行純化。（這個部分我們需要多查些資料看下）Nanodisc與膜蛋白的組裝結(jié)構(gòu)使得膜蛋白能夠在體外研究膜蛋白在生理上細胞內(nèi)和細胞外的兩面，因此也使得進一步研究拮抗劑，激動劑，G蛋白以及其他相互作用的配體等不再受限。
3）Nanodiscs優(yōu)勢：
Nanodiscs能夠為提取出來的膜蛋白提供一個穩(wěn)定環(huán)境使它們繼續(xù)工作，就好像還沒有離開原來細胞膜一樣。 細胞膜蛋白之所以研究難度大是在于膜蛋白從細胞膜上提取出來以后就無法行使其正常功能，使得研究這些受體分子相當(dāng)困難。為了解決這項難題，Stephen Sligar 等科學(xué)家研發(fā)出一種脂質(zhì)納米圓盤 (lipid-based Nanodiscs)可以替代細胞膜上磷脂雙層膜 (phospholipid bilayer)，讓被純化出來的細胞膜蛋白如同一般細胞膜蛋白一樣穩(wěn)定地行使其正常功能。
Nanodiscs和天然的細胞膜的組成結(jié)構(gòu)一樣，是由兩層磷脂層組成的，每個磷脂分子都有活躍并親水的頭部基團和疏水尾部。Nanodiscs 的結(jié)構(gòu)就像一般細胞膜一樣，由兩層背對背的磷脂 (phospholipid)所組成，為了使納米圓盤表面能保持這個扁平的形狀，研究人員給這個Nanodiscs 外面加上一圈蛋白質(zhì)(MSPs)。
Nanodiscs應(yīng)用前景非常廣泛，這個技術(shù)將有助于解開一大堆未知的膜蛋白的生化行為模式，也將有可能幫助得到膜蛋白的結(jié)晶，從而應(yīng)用X 射線晶體衍射學(xué)獲得在原子水平上的結(jié)構(gòu)圖。
4）將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法：
方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在適合去污劑存在下，將膜蛋白溶解并純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
方法2：Nanodiscs與無細胞表達體系相結(jié)合
另一個方法是，膜蛋白在無細胞表達體系中被表達，通過加入已經(jīng)和膜蛋白結(jié)合預(yù)先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過無細胞表達系統(tǒng)表達出來。采用這種方法，就無需再添加去污劑，在很大程度上降低了人為添加試劑對結(jié)果的影響。
雖然通過無細胞表達體系會將蛋白的產(chǎn)量限制在微克級別，但這種方式卻為蛋白修飾，如生物素?；蛲凰貥?biāo)記等研究手段提供了更多發(fā)展方向的可能性。
圖2：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機制
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復(fù)合物。
右圖：預(yù)組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。
5）Nanodiscs的應(yīng)用
Nanodiscs為膜蛋白在體外提供了非常穩(wěn)定的環(huán)境，并且可以在這個環(huán)境下研究配體的結(jié)合，或用NMR和SPR研究拮抗劑與激動劑。MSPs可以與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合來促進純化、檢測和固定化。
Nanodiscs其他方面的應(yīng)用還包括共振拉曼（resonance Raman），低溫電子顯微學(xué)(Cryo-EM)，MALDI ，蛋白活性研究和時間分辨熒光光譜。將抗原組裝到Nanodiscs中已經(jīng)被用來提高小鼠的免疫反應(yīng)，說明其具備用于制備疫苗和生產(chǎn)抗體的極大潛能。最近，大腸桿菌全細胞膜蛋白組被組裝到了Nanodiscs中，為以后的研究構(gòu)建了一個可溶解的膜蛋白信息庫。表2中例舉了很多Nanodiscs的應(yīng)用。
表2 Nanodiscs應(yīng)用舉例
應(yīng)用 | 蛋白 | 來源 |
激動劑、拮抗劑、G蛋白放射性標(biāo)記交換研究 | β-腎上腺素受體 2 | 人 |
NMR | 外膜蛋白X | 細菌 |
CD4突變體 | 人 |
SPR | CD4突變體 | 人 |
共振拉曼光譜 | 細胞色素 P450 | 哺乳動物 |
冷凍電子顯微鏡 | SecYEG復(fù)合體 | E.coli |
MALDI-MS | 各種蛋白 | 各種來源 |
蛋白磷酸化/激活研究 | 表皮生長因子受體 | 人 |
EM | 捕光色素復(fù)合體Ⅱ | 菠菜 |
時間分辨熒光光譜 | 捕光色素復(fù)合體Ⅱ | 菠菜 |
小鼠免疫 | 血凝素A | 流感病毒 |
固態(tài)NMR | 綠色視紫質(zhì)膜蛋白 | 海洋細菌 |
放射配體結(jié)合/閃爍近親測定法 | LeuT轉(zhuǎn)運蛋白 | 原核生物 |
NMR分析脂質(zhì)相互作用 | 磷脂酰肌醇結(jié)合蛋白 | 人 |
（來源：Sligar Lab）
在過去幾年里，業(yè)內(nèi)已經(jīng)發(fā)表了多篇關(guān)于Nanodiscs的應(yīng)用文獻，例如：Nanodisc系列產(chǎn)品MSP1D1-His和MSP1D1dH5-His的應(yīng)用已刊登在《美國化學(xué)會-應(yīng)用材料與界面》（ACS Applied Materials & Interfaces），Cube Biotech首席科學(xué)家Dr. Barbara Maertens、法蘭克福大學(xué)生物物理化學(xué)研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊聯(lián)合發(fā)表文章并提出Cube Biotech 研制的Nanodisc(納米磷脂盤)是用于高效提取膜蛋白以及研究膜蛋白結(jié)構(gòu)/功能的新工具。目前，許多研究人員正在利用這項新技術(shù)研究出更多與之相關(guān)的技術(shù)與應(yīng)用。
圖3：有關(guān)Nanodiscs的文獻發(fā)表情況。從2003—2013年，利用Nanodiscs進行膜蛋白研究的相關(guān)報道在不斷增加。（來源：PubMed）
6）獲得Nanodiscs
Cube Biotech提供四種尺寸的Nanodiscs,其由四種MSPs(MSP1D1/MSP1D1-dH5/MSP1E3D1/ MSP2N2)來實現(xiàn)、Nanodiscs試劑盒(包含MSP、磷脂和膽酸鈉)和預(yù)組裝的Nanodiscs。
產(chǎn)品列表：
Cube Biotech
Nanodisc | Nanodisc 試劑盒 |
MSPs尺寸 | 規(guī)格 | MSPs尺寸 | 匹配磷脂 |
MSP1D1 | 2mg | MSP1D1 | DMPC |
10mg | POPC |
MSP1D1-dH5 | 2mg | MSP1D1-dH5 | DMPC |
10mg | POPC |
MSP1E3D1 | 2mg | MSP1E3D1 | DMPC |
10mg | POPC |
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