首頁(yè)Cube Biotech瓊脂糖基質(zhì)的選擇
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Twiitter瓊脂糖由瓊脂二糖的重復(fù)單元組成，瓊脂糖珠通常是交聯(lián)多孔的，因此蛋白質(zhì)可以流過(guò)珠子的孔隙。瓊脂糖珠?？捎糜诜肿优抛杌蛴H和層析，對(duì)于親和層析，配體（如NTA或IDA）與瓊脂糖珠聚合物共價(jià)連接，可以將帶標(biāo)簽的蛋白與其他蛋白分離。瓊脂糖基質(zhì)用于蛋白質(zhì)的純化已有幾十年的歷史，市售的基于瓊脂糖的基質(zhì)種類繁多，不同基質(zhì)之間的物理性質(zhì)可能大不相同，我們這篇簡(jiǎn)短的總結(jié)將幫助您找到最佳的產(chǎn)品。
Superflow，Sepharose，Agarose的區(qū)別
Agarose
PureCube瓊脂糖交聯(lián)度高且在高壓下穩(wěn)定，可與Sepharose和Superflow基質(zhì)相媲美（見(jiàn)表1）。如果需要高流速和高蛋白質(zhì)結(jié)合能力，新型PureCube 100瓊脂糖（用于帶His標(biāo)簽蛋白的親和純化）是不錯(cuò)的選擇。
Sepharose
Sepharose代表的是GE公司不同濃度和大小的交聯(lián)瓊脂糖，其瓊脂糖的性質(zhì)取決于瓊脂糖的濃度和交聯(lián)度，但并非所有該品牌的瓊脂糖凝膠基質(zhì)都適用于FPLC等應(yīng)用。
Superflow
Superflow是由另外幾家公司生產(chǎn)的，指的是高度交聯(lián)和壓力穩(wěn)定的瓊脂糖變體，適用于FPLC實(shí)驗(yàn)。Superflow主要用于區(qū)分壓力穩(wěn)定的瓊脂糖和其他用于批次純化的交聯(lián)度較低的瓊脂糖。
表1：三種瓊脂糖基質(zhì)的比較
類型 | Cube Biotech | 供應(yīng)商G | 供應(yīng)商 |
材料 | 高度交聯(lián)的瓊脂糖 | 高度交聯(lián)的瓊脂糖 | 高度交聯(lián)的瓊脂糖 |
瓊脂糖濃度 | PureCube：7.5％ | 6％/ 4％ | 4％ |
孔徑大小 | 中等 | 中等 | 中等 |
平均粒徑 | PureCube： 40 μm | 34 μm（HP） | 60-160 μm |
線性流量 | > 500 cm / h（PureCube） | > 150 cm/h | > 150 cm/h |
最大流速 | 6 ml/min | 4或20 ml/min（1或5 ml色譜柱） | 20 ml/min |
結(jié)合能力（帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)和Ni-NTA） | 高達(dá)80毫克 | 高達(dá)40毫克 | 高達(dá)50毫克 |
圖3：瓊脂糖濃度和交聯(lián)度對(duì)基質(zhì)孔徑和剛性的影響。
A. 低濃度瓊脂糖
B. 高濃度、低交聯(lián)度瓊脂糖
C. 高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖
綠線：瓊脂糖聚合物；紅點(diǎn)：交聯(lián)處
圖4：用雙-ANS染料染色的Cube Biotech瓊脂糖珠。本圖由德國(guó)科隆PAIA Biotech友情提供
為什么蛋白質(zhì)能與瓊脂糖珠結(jié)合？
瓊脂糖珠本身不與蛋白質(zhì)結(jié)合。它們必須與配體（如NTA，谷胱甘肽或抗體）連接，通過(guò)特定的相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化。對(duì)于親和層析，最常用的瓊脂糖珠是鎳-NTA瓊脂糖珠。
離子交換色譜
一些官能團(tuán)如季胺，DEAE，磺丙基或羧甲基等可以與瓊脂糖偶聯(lián)，分別產(chǎn)生強(qiáng)或弱的陰、陽(yáng)離子交換劑。對(duì)于離子交換色譜，蛋白質(zhì)不需要親和標(biāo)簽，使得該方法適用于純化天然來(lái)源的蛋白質(zhì)。
凝膠過(guò)濾/分子排阻色譜
交聯(lián)瓊脂糖無(wú)需進(jìn)一步修飾即可用于分子排阻色譜，其分辨率和分離范圍取決于瓊脂糖的孔徑大小。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，瓊脂糖濃度與分離能力的相關(guān)性如下：
表2：瓊脂糖濃度與蛋白質(zhì)排阻極限的關(guān)系
瓊脂糖濃度 | 蛋白質(zhì)排阻極限（球狀蛋白質(zhì)） |
4% | 約30,000 kDa |
5% | 約10,000 kDa |
6% | 約4,000 kDa |
7.5% | 約1,200 kDa |
9% | 約150 kDa |
孔徑大小
初始瓊脂糖的濃度越高，那么交聯(lián)后形成的孔徑就越小，如果要將瓊脂糖用于分子排阻色譜，它的這個(gè)特性尤為重要。
壓力穩(wěn)定
初始瓊脂糖濃度越高，交聯(lián)度越高，瓊脂糖珠子耐壓性越好。
尺寸
瓊脂糖具有不同的尺寸和排阻限制，這些特點(diǎn)會(huì)影響純化基質(zhì)的物理性質(zhì)。
壓力
珠粒越小，蛋白質(zhì)分離范圍越窄，珠粒的耐壓性越高。另一方面，珠子越大，批量純化和FPLC實(shí)驗(yàn)中的流速越快。
結(jié)合能力
珠子越小，表面積與體積的比值越大，珠子的蛋白結(jié)合能力越強(qiáng)。但是，需要注意的是結(jié)合能力還取決于其他因素，如配體的類型和大小，以及配體偶聯(lián)的密度。
動(dòng)態(tài)結(jié)合能力
較高流速下純化柱內(nèi)會(huì)產(chǎn)生壓力，使得親和色譜材料結(jié)合蛋白的能力降低，而該效果取決于瓊脂糖珠粒大小、瓊脂糖含量和交聯(lián)度。動(dòng)態(tài)結(jié)合能力可以告訴我們?cè)摥傊遣牧鲜欠衲茉诟吡魉傧率褂枚挥绊懙鞍踪|(zhì)的產(chǎn)量。
有關(guān)PureCube瓊脂糖和其他基質(zhì)的比較，請(qǐng)參見(jiàn)圖5。
圖5：PureCube瓊脂糖比競(jìng)品90 μm珠粒尺寸瓊脂糖具有更高的動(dòng)態(tài)蛋白結(jié)合能力。
BSA純化時(shí)使用pH 7.4的Tris緩沖液，采用兩種離子交換基質(zhì)，流速為25-500cm/h，相當(dāng)于0.8×2.5cm柱的0.3-4.0 ml/min。當(dāng)流速高于100 cm/h （0.85 ml/min）時(shí)，競(jìng)品基質(zhì)獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著降低，而PureCube瓊脂糖基質(zhì)即使在500 cm/h （4 ml/ml）的高流速下也顯示出可重現(xiàn)的高蛋白質(zhì)產(chǎn)量）。
