無細(xì)胞蛋白表達(dá)
選擇細(xì)胞裂解物對(duì)活細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)是很有用的,它們可以裂解真核細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞,并去除蛋白質(zhì)中所有不需要表達(dá)的成分。這些裂解物可以與DNA模板和其他所需成分在試管中結(jié)合,進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)(1)。
Figure 1: Cell-free expression components and additives
Figure 2: Production of a target protein with living cells
優(yōu)勢(shì)
1. 無細(xì)胞反應(yīng)很容易建立,僅需幾個(gè)小時(shí)就可以完成蛋白質(zhì)表達(dá)。這種方法可以用小規(guī)模(50-100微升)的反應(yīng)快速完成反應(yīng)條件的優(yōu)化,優(yōu)秀的條件能被線性放大到其所需的數(shù)量。
2. 總處理量小:對(duì)于可溶性蛋白,幾毫升的反應(yīng)就可以得到毫克量的蛋白。
3. 作為一個(gè)開放的系統(tǒng),許多成分(天然的和非天然的),均可以被添加到反應(yīng)混合物中,如還原/氧化元素、分子伴侶、標(biāo)記的氨基酸或去污劑。如此,蛋白質(zhì)可以直接用于核磁共振,也可將膜蛋白在新生狀態(tài)下重組到納米盤系統(tǒng)中,而無需任何人造去污劑(10-12)。
4. 真核細(xì)胞的裂解物能進(jìn)行翻譯后修飾,如糖基化或磷酸化,并可將天然的細(xì)胞膜成分(如微粒體)插入膜蛋白(9)。
5. 通??梢栽跓o細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行活細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá),由于已經(jīng)去除了負(fù)責(zé)(功能)的細(xì)胞成分,所以不會(huì)受到如蛋白消化酶或DNA模板不穩(wěn)定的影響。
6. 多聚體蛋白和復(fù)合物都能被表達(dá),且DNA模板滴定會(huì)影響不同亞基的比例。
劣勢(shì)
1. 如果蛋白質(zhì)需求量大或者蛋白質(zhì)表達(dá)低,無細(xì)胞表達(dá)會(huì)相當(dāng)昂貴。因此,對(duì)于每一種蛋白質(zhì),應(yīng)在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中評(píng)估可達(dá)到的產(chǎn)量,并計(jì)算放大的成本,這對(duì)來自真核生物更復(fù)雜的無細(xì)胞裂解物來說更應(yīng)如此。
表1 不同無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的比較
| 大腸桿菌 | 小麥胚芽 | 昆蟲 | 哺乳動(dòng)物 |
相對(duì)產(chǎn)量 | 高(幾毫克/毫升) | 中 | 中低 | 低 |
相對(duì)成本 | 低 | 中 | 中 | 高 |
磷酸化 | 無 | 有 | 有 | 有 |
糖基化 | 無 | 核心 | 核心 | 哺乳動(dòng)物 |
膜蛋白選擇 | 不溶性納米磷脂盤去污劑 | 脂質(zhì)去污劑 | 天然內(nèi)體納米磷脂盤 | 天然微粒體脂質(zhì)去污劑 |
市售 | mastermix CECF 試劑盒批次單獨(dú)的細(xì)胞裂解物 | CECF 試劑盒批次 | mastermix 批次 | mastermix 批次 |
庫(kù)柏生物供應(yīng) | 大腸桿菌細(xì)胞裂解物和CECF納米磷脂盤去污劑 |
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應(yīng)用
由于蛋白質(zhì)是在一個(gè)開放性的系統(tǒng)中表達(dá)的,與活細(xì)胞表達(dá)相比,無細(xì)胞表達(dá)使許多應(yīng)用受益,包括:
·表達(dá)篩選:通過無細(xì)胞表達(dá),您可以在兩天內(nèi)從DNA模板-甚至是多個(gè)平行應(yīng)得到免疫印跡的結(jié)果,這使得該系統(tǒng)對(duì)于快速篩選多個(gè)構(gòu)建體和反應(yīng)條件更具吸引力。
·蛋白標(biāo)記:開放式系統(tǒng)可以與標(biāo)記的氨基酸相結(jié)合,例如生物素或熒光標(biāo)簽。
·核磁共振:可以很容易地將同位素標(biāo)記的氨基酸添加到混合物中,獲得準(zhǔn)備用于核磁共振的蛋白質(zhì)。
·結(jié)晶:與硒代蛋氨酸結(jié)合,在一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟中獲得蛋白質(zhì)重金屬衍生物。
Figure 2: Production of a target protein with living cells
膜蛋白特殊的適應(yīng)性
由于蛋白質(zhì)是在一個(gè)開放的系統(tǒng)中表達(dá)的,與活細(xì)胞表達(dá)相比,無細(xì)胞表達(dá)促進(jìn)了許多應(yīng)用,包括:
·不溶性表達(dá):在不添加任何種類的脂質(zhì)或去污劑的情況下,形成膜蛋白聚集體,在諸多情況下可以重新折疊成功能蛋白。
·去污劑:尤其是Brij系列的去污劑,多數(shù)情況下將其加入以溶解膜蛋白。如果需要,可以在后續(xù)步驟中交換去污劑,但需要是在純化過程中。(2-7)
·納米磷脂盤:在無細(xì)胞反應(yīng)中加入納米磷脂盤,是獲得穩(wěn)定性蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)便的方法,不需要去污劑,可用于各種檢測(cè)(10-15)。其應(yīng)用范圍包括生物物理學(xué)分析、表面等離子共振、核磁共振和冷凍電鏡的質(zhì)譜分析。最近有研究表明,通過納米磷脂盤,膜蛋白在無細(xì)胞裂解物中的表達(dá)可通過中觀方法進(jìn)行結(jié)晶(14),了解更多關(guān)于納米磷脂盤的信息。
·脂質(zhì)體和其他脂質(zhì)顆粒:如脂質(zhì)體、微粒體和其他含脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)(如雙層膜微胞),已被添加到無細(xì)胞反應(yīng)中,尤其是與昆蟲細(xì)胞裂解物結(jié)合進(jìn)行膜蛋白的表達(dá)(9)。使用適量的去污劑,還可以將膜蛋白從納米磷脂盤轉(zhuǎn)移到雙層膜微胞中(13)。
間歇式和無細(xì)胞持續(xù)交換方法
通常可按兩種方法進(jìn)行無細(xì)胞反應(yīng):
1. 間歇式:可以輕松的在簡(jiǎn)易管中進(jìn)行間歇式無細(xì)胞反應(yīng),如離心管。其反應(yīng)時(shí)間很短(1-3小時(shí)),因?yàn)槟芰课镔|(zhì)很快就被消耗完了,而最終產(chǎn)物的積累會(huì)減緩酶促反應(yīng)的速度,因此蛋白質(zhì)的產(chǎn)量通常會(huì)很低。
2.無細(xì)胞持續(xù)交換或半透膜:無細(xì)胞持續(xù)交換(CECF)反應(yīng)是通過半透膜進(jìn)行的,所以可向反應(yīng)提供能量物質(zhì),并去除最終產(chǎn)物,如ADP。如此,反應(yīng)時(shí)間就可以達(dá)到24小時(shí),對(duì)于表達(dá)量高的可溶性蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)每毫升的產(chǎn)量可以達(dá)到幾毫克(8)。
References:
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19. Schwarz, D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in E.coli based continuous exchange cell-free systems. Nat. Protocols 2, 2945-57 (2007)